: Химический синтез белков в промышленности
: Химический синтез белков в промышленности
Биосинтез белков
Каковы же основные формы связи аминокислот в сложной молекуле белка? Ещё в
1891 г. А. Я. Данилевский высказал предположение, что это амидные связи,
образованные карбоксилом одной молекулы аминокислоты и аминогруппой другой
(поликонденсация типа “голова – хвост”), например:
-H2O
H2N-CH2-C=O +HNHCH2COOH--à
\
OH
à H2N-CH2-CO-NH-CH2-COOH
(пептидная связь)
Амидные связи этого типа называются пептидными связями,а низкомолекулярные
соединения, в которых аминокислоты соединены друг с другом пептидными
связями, принято называть пептидами (или полипептидами).
Пептиды образуются при частичном гидролизе белков. Пептидная теория строения
белка была развита Э. Фишером и Гофмейстером и в настоящее время окончательно
подтверждена.
В зависимости от числа аминокислотных остатков, входящих в молекулу
полипептида, различают дипептиды, трипептиды, тетрапептиды и т. д. .
Характерную для пептидов группировку
-CO-NH- называют пептидной.
Названия полипептидов производят от названий остатков аминокислот,
прореагировавших своими карбоксильными группами, и от названия аминокислоты,
реагирующей своей аминогруппой и сохраняющей свободную карбоксильную группу:
H2N-CH2-CO-NH-CH(CH3)-COOH
глицилаланин(H-гли-ала-OH)
NH2-CH(CH3)-CO-NH-NH2-CO-NH-CH2-COOH
Аланилглицилглицин(H-ала-гли-гли-OH)
К настоящему времени разработано много методов превращения а-
аминокислот в пептиды и синтезированы простейшие природные белки –инсулин,
рибонуклеаза, вазопрессин, окситоцин и др.
Для того чтобы соединить две аминокислоты пептидной связью, необходимо: а)
закрыть (защитить) карбоксильную группу глицина и аминогруппу аланина, чтобы
не произошло нежелательных реакций по этим группам; б) образовать пептидную
связь; в) снять защитные группы. Защитные группы должны надёжно закрывать
аминную и карбоксильную группы в процессе синтеза и потом легко сниматься без
разрушения пептидной связи.
Защита аминогруппы наиболее просто проводится ацилированием:
-HCl
R-COCl+H2N-CH-COOH--àR-CO-NH-CH-COOH
| |
CH2 CH3
Карбоксильную группу для защиты превращают в сложноэфирную:
-HOH
H2N-CH2-COOH+HOR--à H2N-CH2-COOR
Для образования пептидной связи или активируют карбоксильную группу N-
ацилаланина, превращая его в хлорангидрид, или проводят конденсацию в
присутствии сильных водоотнимающих веществ (дициклогексилкарбодиимид,
этоксиацетилен):
-H2O
R-CO-NH-CH-COOH+HNHCH2-COOR--à
|
CH3 гидролиз
à R-CO-NH-CH-CO-NH-CH2-COOR----à
|
CH3
à H2N-CH-CO-NH-CH2-COOH
|
CH3
Затем снимают защитные группы в таких условиях, чтобы не затрагивалась
пептидная связь. Таким образом можно синтезировать не только ди-, но и три-,
и тетрапептиды и т. д. .
Очень перспективный метод синтеза пептидных связей предложил в 1960 г. Мерифильд
(США). Этот метод потом получил название твёрдофазного синтеза пептидов
. Первая аминокислота с защищённой аминогруппой присоединяется к твёрдому
носителю – ионнообменной смоле, содержащей первоначально группы –CH2Cl (1-ая
стадия), с образованием так называемой “якорной” связи, которая обозначена
жирной линией: (1)-NaCl
Смола-CH2Cl+NaOOC-CHR-NHCOR’àСмола- -CH2O-C-CHR-NHCOR’àСмола-CH2O-C-CHR-
|| ||
O O
+HOOC-CHR’’-NHOR(3)
-NH2-----------àСмола-CH2O-C-CHR-
||
(4) O
-NHCO-CHR’’-NHCOR’àСмола-CH2O-C-CHR--NHCO-CHR’’-NH2 и т. д. ||
O
Затем наращивают пептидную цепь, пропуская через смолу растворы
соответствующих реагентов. Для этого сначала убирают группу, защищающую
конечную NH2 – группу (2-ая стадия). Пропуская через смолу раствор другой
аминокислоты с защищённой аминогруппой в присутствии водоотнимающих
реагентов, образуют пептидную связь между первой и второй аминокислотой (3-я
стадия). Если затем убрать защитную группу (4-ая стадия), синтез пептида
можно вести далее. После наращивания пептидной цепи до нужной величины
гидролизуют “якорную” сложноэфирную связь и смывают полипептид со смолы:
HBr
Смола-CH2O-CO-CHR-NH.CO-CHR’NH2---à
àСмола-CH2OH+HOOCCHRNH.COCHR’NH2
Полипептид
Метод Мерифильда прост в техническом оформлении, что позволяет полностью
автоматизировать процесс. Поэтому, хотя вышеупомянутые белки инсулин(51
аминокислота) и рибонуклеаза(124 аминокислоты) были синтезированы
классическими методами, метод Мерифильда позволяет значительно сократить
затраты труда и времени на синтез белков. Так, рибонуклеаза была
синтезирована Мерифильдом в 1968 г. менее чем за месяц, хотя синтез включал
369 последовательных реакций.