Научная Петербургская Академия

: Технология производства низина. Антибиотические свойства низина

: Технология производства низина. Антибиотические свойства низина

Р Х Т У

им. Д.И.Менделеева.

Технология производства низина.

Антибиотические свойства низина.

Выполнила:

студентка группы Э-45

Тимошкина Е.А.

10. 05. 1997

НИЗИНЫ (NISINS).

Низины относятся к антибиотикам, которые образуются собственно бактериями.

Антибиотическое вещество - низин - выделен из культуры молочнокислого

стрептококка Streptococcus lactis. Низин подавляет развитие ряда

грамположительных и некоторых кислотоустойчивых бактерий, не оказывает влияния

на грамотрицательные бактерии, дрожжи и плесневые грибы. Этот антибиотик

подавляет развитие многих микроорганизмов: пневмококки, группу стрептококков,

различные виды Bacillus , Clostridium, Mycobacterium tuberculosis,

Lactobacillus, Corynebacterium, немногие виды Streptomyces, Micrococcus

pyogenes. Низин не оказывает антимикробного действия на Escherichia

coli, Salmonella typhi, Shigella, некоторые виды Neisseria.

Свойства низина, а также особенности его химического строения привлекли к этому

антибиотику внимание ученых. Что касается применения, следует отметить, что

низин не используется в медицинской практике, но с успехом применяется в

ветеринарии для лечения маститов у коров. Также имеет большое применение в

пищевой промышленности в качестве консерванта некоторых скоропортящихся

продуктов, а также для предупреждения порчи сыров. Есть сообщения об активности

низина в отношении малярийного плазмодия, но этот вопрос пока остается не до

конца изученным.

Строение низина.

Установлено, что низин имеет молекулярную массу, равную 3500, он может

полимеризоваться и образовывать димер (молекулярная масса 7000) и тетрамер.

Полимеризацию низина связывают с наличием в его молекуле дегидроаланина. В

состав молекулы низина входят 30 аминокислотных остатков следующих

аминокислот: лизин, гистидин, аспарагиновая кислота, серин, пролин, глицин,

аланин, валин, метионин, изолейцин, лейцин, остатки редко встречающихся

серосодержащих аминокислот: лантионин и b-метиллантионин, ненасыщенные

аминокислоты - дегидроаланин и b-метилдегидроаланин.

В 1970 году установлена следующая структура молекулы низина:

H2N - Иле - Мга - Ала - Иле - Дга - Лей - Ала - Амк - Про - Глу - Ала -

S S

- Лиз - Амк - Гли - Ала - Лей - Мет - Гли - Ала - Асп - Мет - Лиз -

S

S

- Амк-Ала- Амк - Ала - Гис - Ала - Сер - Иле - Гис - Вал - Дга - Лиз - СООН

Дга - дегидроаланин; Амк - аминомасляная кислота; Мга - b-метилдегид-

роаланин. Определено положение двух сульфидных мостиков, образованных

остатками b-метиллантионина. Этот фрагмент имеет бициклическую структуру:

Биологическая активность низина обусловлена наличием в его молекуле

a,b-ненасыщенных аминокислот (дегидроаланин, b-метилдегидроаланин). Димеры и

тетрамеры низина, подобно мономеру, обладают биологической активностью. Низин

влияет на споры чувствительных к нему бактерий, которые более богаты катионами

по сравнению с вегетативными клетками, и выступает как катионитный

детергент. Низин, адсорбируясь на поверхности спор, в момент прорастания

спор нарушает прониаемость цитоплазматичесой мембраны и таким образом подавляет

рост развивающихся клеток бактерий. Этот антибиотик способен реагировать с

сульфгидрильными группами биологически важных соединений, выводя их из реакций

метаболизма.

Технологические стадии производства низина.

1. Приготовление посевного материала.

Штаммы-продуценты

из пробирок

¯

в колбы со стерильной питательной средой на качалки, оптимальные tо и

рН=6.5 - 6.8.

½

½

½

½

½

½

½

½

½

½

½

½

½

½

½ ½

½

½

½

½

½

½

½

½

¯

Инокуляторы для наращивания посевного материала (малый посевной аппарат,

затем большой посевной аппарат; постоянный долив питательной среды)

¯

С понижением рН среды увеличивается выделение низина из клеток в

культуральную жидкость. При рН=4.3 более 90% низина выделяется в среду, а при

рН=6.8 выделяется 40% антибиотика.

ü Но интенсивная аэрация культуры молочнокислого стрептококка не оказывает

благоприятного влияния ни на рост бактерий, ни на образование низина.

Питательная среда: в средах, содержащих недостаточное для нормального

развития количество азота (1-2 мг% NH2 при норме 29 мг%), сильно

снижается рост стрептококка и образование антибиотика. Лучшими азотсодержащими

компонентами в средах являются дрожжевой автолизат, пептон, казеиновый

гидролизат. Высокий выход антибиотика наблюдается при развитии молочнокислого

стрептококка на средах, содержащих аммонийные соли органических кислот.

Источник углерода - глюкоза. Добавление к среде с глюкозой двух-, трех-,

четырех- и пятиуглеродных органических кислот способствует повышению роста

продуцента антибиотика и некоторому увеличению образования им низина.

При засеве свежей питательной среды культурой Streptococcus lactis

вместе с посевным материалом вносится и низин, так как количество общего низина

в процессе развития бактерий снижается и к концу периода лаг-фазы клетки

стрептококка практически не содержат антибиотика. А синтез низина происходит

после экспоненциального роста бактерий в период ранней стационарной фазы.

2. Установка для биосинтеза антибиотика

½

½

½

½

½

½

½

½

½

½ ½

½

½

½ ½

½

½

½

½

½

½ ½

¯

Снижение общего количества низина в лаг-период развития Streptococcus lactis

и синтез антибиотика в более поздний период роста подтверждает значение низина в

качестве важной части бактериального ростового цикла стрептококка (низин,

по-видимому, связан с контролирующим механизмом, который не оказывает влияния

на скорость роста продуцента антибиотика, но задерживает начало роста новых

клеток). Снижение синтеза антибиотика к концу периода лаг-фазы обусловлено

изменением третичной структуры или степени полимеризации антибиотика. Этого

процесса инактивации низина можно избежать путем добавления в среду казеина, в

результате чего наблюдается стабилизация антибиотической активности и большое

образование низина. У низина в отличие от других полипептидных антибиотиков

путь синтеза сходен с путем образования белков, т.е. связан с рибосомным

механизмом. Синтез низина идет через образование низиноподобных

белков-предшественников биосинтеза антибиотика, причем превращение пренизина в

низин происходит под действием фермента на внешней поверхности клетки

стрептококка (есть предположение и о том, что ответственность за биосинтез

низина несут определенные плазмиды, в которых локализованы соответствующие гены

образование молекулы антибиотика). Сам механизм биосинтеза низина и его

молекулярная масса позволяют рассматривать этот антибиотик не как полипептид, а

как низкомолекулярный основной белок.

3. Стадия предварительной обработки культуральной жидкости, клеток

микроорганизма и фильтрации (отделения культуральной жидкости от биомассы

продуцента).

½ ½

½

½

½ ½

½

½

½

½

½

½ ½ ½ ½

¯

В результате рассмотренных аспектов биосинтеза видно, что образуемый антибиотик

почти полностью выделяется из клеток в культуральную жидкость (бóльшая

часть его). Тогда антибиотик выделяют из культуральной жидкости методами

экстракции растворителями, не смешивающимися с жидкой фазой, осаждают в виде

нерастворимого соединения или сорбируют ионообменными смолами. При содержании

антибиотика (как в нашем случае) в культуральной жидкости и в клетках

продуцента, первичной операцией его выделения является перевод антибиотика в

фазу, из которой наиболее целесообразно его изолировать. При этом антибиотик,

содержащийся в культуральной жидкости, и клетки с антибиотическим веществом,

переводят в осадок, из которого антибиотик экстрагируют. Отделение нативного

раствора от биомассы и взвешенных частиц проводят методами фильтрации

(нутч-фильтр, друк-фильтр, сепараторы) или центрифугирования.

Стадия выделения и очистки антибиотика

¯

½

½

½

½

½

½

½

½

½

½

½

½

½

½

½

½

½

½

½

½

½

½

¯

Во избежание инактивации антибиотика под влиянием внешних факторов при его

выделении и очистке необходимо соблюдать максимальную осторожность.

Основные методы очистки:

Метод экстракции (Многократный перевод антибиотика из одного растворителя

в другой с предварительным осаждением (кристаллизацией)).

Ионообменная сорбция (Пропускание водного раствора антибиотика через

колонки с соответствующими ионообменными смолами, сорбция на них, а раствор с

примесями, имеющий противоположный антибиотику заряд, проходит через колонку.

Адсорбированный на смоле антибиотик элюируют, получают очищенный,

концентрированый препарат. А раствор можно вновь пропустить через ионообменную

смолу, но с противоположным зарядом, тогда на смоле осядут примеси, а более

очищенный раствор пройдет через колонку.

Осаждение (Связывание антибиотика с веществами с целью получения

соединения, выпадающего в осадок, который с помощью фильтров или

центрифугирования отделяют от нативного раствора, промывают, высушивают.

Образовавшееся соединение растворяют и антибиотик экстрагируют или вновь

осаждают. )

Одна из стадий очистки - концентрирование полученных растворов (отгонка

большей части растворителя в вакууме).

Стадия сушки, получение готовой продукции, изготовление лекарственных форм

(биологический и фармакологический контроль), расфасовка.

Виды сушки: лиофильная сушка (при температуре -8, -12 °С)

распылительная сушилка (раствор антибиотика пневматически распыляется до

мельчайших капель в камере с потоком нагретого воздуха)

сушка в вакуум-сушильных шкафах (для высушивания зернистых и

пастообразных антибиотических препаратов).

Расфасованный и упакованный антибиотик с указанием показателя биологической

активности, даты выпуска и срока годности поступает в продажу.



(C) 2009